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飼料中黃曲霉毒素B1檢測方法

飼料中黃曲霉毒素B1檢測方法


一、使用單位需自備的設(shè)備及試劑

(1)儀器

微孔板酶標(biāo)儀(450 nm/630 nm)

氮氣吹干裝置

振蕩器

離心機

渦旋儀

粉碎機

電子天平(感量0.01 g)

(2)器材

單道微量移液器:20 μL~200 μL,100 μL~1000 μL

多道微量移液器:30 μL~300 μL

(3)試劑

黃曲霉毒素B1試劑盒。


二、溶液的配制

樣本前處理需配制:

配液1:樣品稀釋液:將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9 體積比進行稀釋(1 份濃縮樣品稀釋液+9 份去離子水)。

配液2:洗滌工作液:將濃縮洗滌液用去離子水按1:9 體積比進行稀釋(1 份濃縮洗滌液+9 份去離子水)。

配液3:樣品提取液:用去離子水將甲醇按3 : 2 體積比進行稀釋(3 份甲醇+2 份去離子水)用于提取樣本中的黃曲霉毒素。


三、樣本前處理方法

樣本處理前須知:

處理任何樣本時,都須注意:

(1)實驗中必須使用一次性吸頭,在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

(2)實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,必須使用潔凈實驗器具,以避免污染干擾實驗結(jié)果。


樣本前處理步驟:

(A)谷物(大米、玉米、小米等低脂含量)及配合飼料

1. 取5 g 粉碎樣品,加入25 mL 樣品提取液;

2. 充分振蕩混勻5-10 min;

3. 4000 r/min 離心5 min,或用定量分析濾紙過濾;

4. 取0.2 mL 離心后的上清液或過濾后的濾液加入到1 mL 樣

品稀釋液中進行稀釋并充分混勻;

5. 取50 μL 稀釋后的樣品待測。

稀釋倍數(shù):30

(B)花生、花生餅等油脂高的飼料

1. 取5 g 粉碎的樣品,加入20 mL 石油醚或正己烷和25 mL樣品提取液;

2. 充分振蕩混勻5-10 min;

3. 離心或靜置分層后去除上層液體;

4. 取0.2 mL 下層液體加入到1 mL 樣品稀釋液中進行稀釋并充分混勻;

5. 取50 μL 稀釋后樣品待測。


四、酶聯(lián)免疫檢測步驟

測定前須知:

1、使用之前將所有試劑和需用微孔板回升至室溫。

2、使用之后立即將所有試劑放回2~8 ℃。

3、在使用中不要讓微孔干燥。

4、在ELISA 分析中的重復(fù)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA 測定程序中的要點。

5、在所有恒溫孵育過程中,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。


測定步驟:

1、將所需試劑和微孔板從冷藏環(huán)境中取出,在室溫下平衡30 min,每種液體使用前均須搖勻。注意標(biāo)準(zhǔn)液均需做2個平行試驗。

2、加標(biāo)準(zhǔn)品:加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 L 到對應(yīng)的微孔中,再加入酶標(biāo)記物50 L/孔,然后再加入50 L/孔抗體工作液,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)30 min。

3、洗板:小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,加洗滌液250μL/孔,每次浸泡15~30 s,充分洗滌4~5 次,用吸水紙拍干。

4、顯色:加入底物液A 液50 μL/孔,再加底物液B 液50 μL/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境反應(yīng)15 min。

5、測定:每孔各加50 μL 終止液,設(shè)定酶標(biāo)儀在450 nm 處,測定OD 值(建議用450/630 nm 雙波長檢測,在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))。



TEL:13798128437

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